奧林巴斯顯微鏡:DIC顯微鏡的基本概念

2020-09-04 09:57:31



活細胞等透明,未染色的標本往往是難以觀(guān)察到,在傳統的明照明下使用全孔徑和分辨率的顯微鏡的物鏡和聚光系統。,首先在20世紀30年代開(kāi)發(fā)的釉澤尼克相襯,經(jīng)常使用這些具有挑戰性的標本圖像,但該技術(shù)受到暈文物,被限制到非常薄的樣品準備,不能利用充分聚光鏡物鏡孔。


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基本差干涉對比(DIC)的系統,在1955年首次由Francis史密斯設計,兩個(gè)渥拉斯頓棱鏡附加的,一個(gè)聚光鏡的前焦平面的變形的偏振光顯微鏡物鏡的后焦平面的第二上面的(參見(jiàn)圖1)。幾年后,喬治諾馬斯基,波蘭出生的法國物理學(xué)家,修改了標準的的沃拉斯頓棱鏡配置使這些極其薄的光學(xué)元件的物理位置遠離光圈共軛平面。


微分干涉對比顯微鏡的光學(xué)元件不掩蓋或以其他方式阻撓的物鏡聚光鏡孔(如相或霍夫曼調制對比),從而使儀器能夠被完整的數值孔徑。其結果是分辨率顯著(zhù)改善(尤其是沿光軸),消除暈文物,并有能力產(chǎn)生極好的圖像比較厚的標本。此外,微分干涉對比產(chǎn)生一個(gè)圖像,可以容易地控制使用的數字視頻成像技術(shù),以進(jìn)一步增強對比度。


1中顯示的是典型的微分干涉對比配置為一體的現代化還配備熒光照明的透射光顯微鏡?;镜墓鈱W(xué)計劃類(lèi)似于一個(gè)傳統的偏光顯微鏡加裝專(zhuān)門(mén)分光棱鏡。甲插入聚光鏡之前和之后的物鏡的光學(xué)路徑的偏振器和分析器。(改性渥拉斯頓或利用Nomarski)幾個(gè)光束分離棱鏡設計,以適應具有不同的焦距和光圈尺寸的聚光鏡安裝在轉臺組件的物鏡,而一個(gè)單一的利用Nomarski棱鏡(兼容所有物鏡式樣)駐留在一個(gè)滑塊幀定位在物鏡轉換器。這些輔助部件的相對的光的方向和順序定位也表示在圖中。


與相襯,微分干涉對比標本光學(xué)路徑長(cháng)度為振幅的差異,可以提高對比度,可視化產(chǎn)生的圖像轉換梯度。的檢體的光程差是由折射率差之間的檢體及其周?chē)?a title='介質(zhì)' target='_blank' class='seolabel'>介質(zhì)中,經(jīng)過(guò)的光束的光路上的兩個(gè)點(diǎn)之間的幾何距離(厚度)的商品。微分干涉對比顯微鏡的圖像有一個(gè)獨特的影子投外觀(guān),仿佛他們是從一個(gè)非常斜的光源從單一方位照亮。不幸的是,這種效果,往往呈現標本中的偽三維浮雕,由不知情的顯微鏡技術(shù)經(jīng)常被認為是實(shí)際地形結構的一個(gè)指標。


微分干涉對比顯微鏡不同于傳統的雙光束干涉儀器的情況,在很大程度上是一種定性的而非定量的技術(shù)。標本進(jìn)行采樣,由兩個(gè)緊密間隔的部分相干的,但正交的,分隔的波陣面的距離稍稍下方的顯微鏡的橫向分辨率。由于采樣光束和參考光束遍歷試樣類(lèi)似的區域(和/或周?chē)橘|(zhì)),該密閉空間的間隔距離小于2微米,DIC,因此無(wú)法產(chǎn)生精確的測量試樣的折射率或厚度。相反,該技術(shù)可用于確定相梯度方向,并充分利用物鏡光圈超越眼前的焦平面標本功能定位的模糊干擾產(chǎn)生薄的光學(xué)部分。


微分干涉對比中采用的波對所產(chǎn)生的來(lái)源于鎢燈絲的平面偏振的相干光的波陣面的雙折射分束器(無(wú)論是一個(gè)的渥拉斯頓或利用Nomarski化合物棱鏡)的動(dòng)作的前焦面的顯微鏡聚焦到聚光鏡(分束器的位置)。當由分束器產(chǎn)生的一對相干光遇到相位梯度,由于折射率和/或厚度的變化,將成為變形和每條射線(xiàn)在遍歷試樣時(shí),遇到一個(gè)稍微不同的光程差。剛剛從檢體時(shí),光線(xiàn)將是不相等的相位。的光程差是翻譯由DIC顯微鏡目鏡中觀(guān)察到在最終圖像中的振幅變化成。然而,從簡(jiǎn)單地檢驗圖像,它是不可能的,以確定是否在試樣的相位梯度的折射率或厚度(或兩者)的差異的原因。這種不確定性是由于這樣的事實(shí):折射率和厚度的產(chǎn)品是來(lái)自于光程差,缺乏任一數量的獨立的信息,原產(chǎn)地的差異,不能確定。


光束分離棱鏡的試樣通過(guò)相位梯度所產(chǎn)生的波陣面后,通過(guò)微分干涉復合第二棱鏡和分析器(另一個(gè)偏振片)的梯度,得到高對比度的再現。依賴(lài)于試樣的采樣光束和參考光束之間的相位差,振幅變化的基礎上產(chǎn)生一個(gè)圖像的兩個(gè)微分干涉對比,相位相反的。相襯圖像轉換從試樣衍射光波和參考光束通過(guò)聚光鏡的環(huán)形帶,試樣和相位板之間表現出的相位變化的振幅信息。DIC圖像的區別,但是,對應于數學(xué)的一階導數的大小,從試樣得到的光程差的梯度分布,而不是。


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DIC的顯微鏡的光路中的梯度和強度分布之間的關(guān)系示于圖2。圖2a)中提出的標本是一個(gè)環(huán)形的人紅細胞微分干涉對比與剪切軸由雙箭頭(西北向東南)表示在高放大倍率成像。的光程差(縱軸)的詩(shī)句甲積紅細胞的直徑沿剪切軸(橫軸)是圖2b)中所示。需要注意的是光路配置文件反映了薄中心厚邊展出人體紅細胞??缥⒎指缮鎸Ρ榷鹊膱D像,非常密切的對應的光程差曲線(xiàn)(圖2b)),當添加到一個(gè)恒定的一階導數,在圖2c)的強度掃描。正面和負面的道中的紅細胞的光路配置文件生成區域的較高和較低的幅度,分別在一階導數的掃描和相應的微分干涉相襯圖像。的光程差分布的區域的,沒(méi)有表現出的斜率變化為背景,以有相同的強度對應的光程差的一階導數的積的基線(xiàn)。


微分干涉對比光學(xué)配置


戰略布局的精確匹配的光學(xué)元件(或)共軛附近的飛機和其他的特定位置,于顯微鏡微分干涉對比(參見(jiàn)圖1)的配置方案是必不可少的。所有的主要制造商提供高品質(zhì),精密DIC的光學(xué)配件,往往在銷(xiāo)售工具包,為他們倒正派研究顯微鏡。在一般情況下,只有四種基本組件都需要配置研究或標準實(shí)驗室的明視野顯微鏡觀(guān)察,微分干涉對比:


· 線(xiàn)性偏振器 -插入到在顯微鏡光端口(或后的任意位置的照明光源聚光透鏡)和聚光透鏡組件(參見(jiàn)圖1和圖3)之間的光學(xué)路徑中,該組件被設計為產(chǎn)生必要的平面偏振的光干擾的成像。振動(dòng)面的電矢量分量的透射軸被定向在一個(gè)東-西的方向(從右到左,在顯微鏡前站立時(shí)),典型的一個(gè)標準的偏光顯微鏡。某些微分干涉對比設計包括一個(gè)旋轉偏振器結合為四分之一波長(cháng)的相位差板,在此位置在顯微鏡。同時(shí),這些組件被稱(chēng)為一個(gè)Sénarmont補償,并設計用于調節圖像的對比度,如隨后將要討論的,以提供更精確的控制。


· 聚光鏡渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡 -為了分離成兩個(gè)部分偏振光從偏振片發(fā)出的,一個(gè)專(zhuān)門(mén)的光束分離棱鏡(通常稱(chēng)為為聚光鏡棱鏡)被置于聚光鏡光圈光闌孔徑的共軛焦點(diǎn)面或其附近的如在圖3中示出。事件平面偏振光波前分割(或剪切)到相互垂直正交偏振分量(稱(chēng)為普通非凡的波前)沃拉斯頓棱鏡諾馬斯基。


· 物鏡利用Nomarski棱鏡 -后面的物鏡位置(圖3),可以在一個(gè)可調節的滑動(dòng)框架或固定安裝,第二光束分離棱鏡采用重組剪切的波陣面的共軛面的物鏡后孔徑。此組件,這是至關(guān)重要的干擾和圖像形成的元素,也被稱(chēng)為物鏡棱鏡。在大多數情況下,在聚光鏡物鏡焦平面下棱鏡的設計和光學(xué)特性不同,以確保干涉顯微鏡孔徑平面光學(xué)共軛的平面重合。


· 分析儀 -第二線(xiàn)性偏振物鏡棱鏡后面,通常安裝在顯微鏡物鏡轉換器之間的中間管和觀(guān)察(目鏡)管。稱(chēng)為一個(gè)分析器,該偏振元件位于前管透鏡(無(wú)限遠校正的顯微鏡)和圖像平面(圖3)中的光學(xué)路徑。該分析儀的方向(北-南)的電場(chǎng)矢量垂直于的臺下偏振器的透射軸。圓形和橢圓偏振光,通過(guò)分析儀和隨后到達從物鏡棱鏡通的組件進(jìn)行干擾產(chǎn)生DIC圖像中間顯微鏡影像平面(目鏡固定膜片或相機系統投影鏡頭光圈)。


當渥拉斯頓和/或利用Nomarski棱鏡從微分干涉顯微鏡的光學(xué)路徑中刪除,光學(xué)配置相當于調整的最大消光(正交偏光)的標準偏振儀器。由于DIC技術(shù)依賴(lài)于平面偏振光,雙折射標本或緊張光學(xué)元件,可干擾圖像強度,生產(chǎn)未聚焦的明亮區域,否則暗(或黑色)背景。出于這個(gè)原因,DIC顯微鏡的配置應采用無(wú)應變的物鏡和(優(yōu)選)聚光透鏡元件。標準顯微鏡物鏡通常包含應力簽名的鏡頭坐騎緊張,閉塞和雙折射的不均勻性,在鏡頭產(chǎn)生的玻璃。這些缺陷往往會(huì )導致降低的對比度水平,它可以產(chǎn)生嚴重的后果的最終圖像的保真度。此外,分離的波陣面的接近(略小于衍射限制的分辨率)需要高精度的顯微鏡物鏡的規格,特別是在大的放大倍數,為了實(shí)現這種技術(shù)的能力的完整分辨率。


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3給出了通過(guò)一個(gè)典型的DIC顯微鏡的光學(xué)列車(chē)是一種理想化的主要組件和光路的概略圖。透過(guò)偏振片射出的局部區域的燈絲通形成直線(xiàn)偏振光方向平行的軸線(xiàn)的相干波陣面由相鄰的偏光元件(相對于45度的頁(yè)面的平面)的雙箭頭所示。渥拉斯頓組合棱鏡位于聚光鏡上的前焦面的偏振波陣面會(huì )聚。


由棱鏡(下面討論),剪切后得到的正交或相互垂直的波陣面被示為一系列的紅色雙箭頭(波前平行于頁(yè))點(diǎn)和藍點(diǎn)(波前垂直于頁(yè)面)。一旦他們所走過(guò)的光路梯度標本中,波前聚集的物鏡和收斂后焦平面,第二沃拉斯頓棱鏡定位。重組的波陣面,然后穿過(guò)第二偏振器(分析儀),其中偏振元件相對于子聚光鏡型偏振器(90度)的左側的黑色雙箭頭所指示的透射軸的方向與。注意聚光鏡棱鏡成像到圖3中的物鏡棱鏡,所以,在每一點(diǎn)上的棱晶(相對于彼此反轉)沿表面相匹配的波前的剪切。翻譯沿剪切軸(垂直于顯微鏡光軸平行于頁(yè),如下面所討論的)的任一棱鏡產(chǎn)生的波陣面的不匹配是均勻的跨顯微鏡孔徑。


沃拉斯頓和諾馬斯基棱鏡


雙折射的沃拉斯頓和/或諾馬斯基棱鏡插入在光學(xué)通路與剪切軸取向成45度角(西北向東南),偏光器和分析儀。兩個(gè)精密研磨和拋光的板坯生產(chǎn)的高品位的光學(xué)石英,單軸雙折射晶體楔形棱鏡組成的。必須制作兩個(gè)石英楔具有垂直方向的光軸,以產(chǎn)生一個(gè)單一的渥拉斯頓棱鏡(或利用Nomarski)。楔形件上面的斜邊膠合在一起,以產(chǎn)生光學(xué)各向異性的復合板,其中的第一楔形晶體的光軸垂直于光軸的第二楔形。入射的直線(xiàn)偏振光進(jìn)入棱鏡的偏振光以45度的角度,在與光軸取向在聚光鏡孔徑的波陣面被劃分成兩個(gè)獨立的正交波,稱(chēng)為普通特殊的波。


相互垂直的不尋常和普通的組成部分的波陣面是一致的,在相同的方向上具有相同的幅度(70.7%的原來(lái)的極化波),以及旅游,通過(guò)渥拉斯頓棱鏡的下半部分。然而,波以不同的速度傳播,由介電性能的低雙折射石英結晶楔的沿軸和快軸的定義。普通波通過(guò)棱鏡所得的快軸方向(具有低的折射率),而通過(guò)慢軸,它具有更高的折射率的非尋常光的行進(jìn)。石英,快軸和慢軸之間的折射率差約為0.6%,和快軸的取向垂直于晶軸的楔形。因此,普通的波穿過(guò)石英楔部,而垂直于光軸的方向平行于該軸的異常波。


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膠結石英楔子,剪切角的角度定義為空間上分開(kāi)的波成為上面的折射率之間的交界處發(fā)生的波陣面的角度分割或剪切。在這個(gè)邊界,普通且平凡的波也交換身份(圖4)。一個(gè)波陣面(普通)從低折射率的介質(zhì)傳播到較高的折射率的第二介質(zhì)(上楔塊)和彎曲朝向的法線(xiàn)(垂直于的楔子光軸的),根據斯涅耳定律。秒的波陣面(特別)離開(kāi)高折射率的介質(zhì)進(jìn)入的第二介質(zhì)的折射率低,彎曲的波前相差的正常,但作為第一個(gè)波陣面在相同的角度。


剪切角和分離距離是恒定的整個(gè)面部的棱鏡的所有事件的波陣面,無(wú)論的入口點(diǎn)。波陣面的剪切的方向被定義由棱鏡剪切軸,在于渥拉斯頓棱鏡的平面是平行的光學(xué)軸(晶體學(xué))的的石英楔部的下(如圖4中所示)。其結果是,將一個(gè)進(jìn)入Wollaston棱鏡的偏振波陣面的剪切軸方向平行的方向,而另一種是面向垂直于該軸。剪切角是由棱鏡組件的設計(石英楔角,不到一定程度的電?。?,并在顯微鏡中無(wú)法調整。然而,剪切距離為分鐘(通常小于一個(gè)微米),沒(méi)有可觀(guān)察到的光束分離發(fā)生在從棱鏡射出。


在旅途中通過(guò)較低的石英楔子在渥拉斯頓棱鏡,普通和特殊的波陣面遇到不同的折射率,如上所討論的。其結果是,在普通的波陣面通過(guò)比非凡的波陣面的晶體在一個(gè)較高的速度傳播。于石英楔子的下限和上限之間的界面的波陣面的交換身份時(shí),普通的波陣面的變成非凡的波陣面的,反之亦然。此外,波陣面時(shí),通過(guò)下部和上部的一半的渥拉斯頓棱鏡的幾何路徑是相同的,經(jīng)過(guò)棱鏡的下半部分中的相移(由于折射率差),在上半部完全補償(圖b)段)。離中心體驗的旅程,通過(guò)較長(cháng)的下棱鏡楔前被剪(圖4C)),或上楔形剪切后(圖4a)),在退出之前穿過(guò)棱鏡的波陣面。由波陣面擴展的距離通過(guò)單棱鏡楔最終使波(無(wú)論是普通的(圖4a)條)或非經(jīng)常性(圖4c))領(lǐng)先于其他到達石英空中接口橫向面的棱鏡,每單位長(cháng)度的恒定相移發(fā)生在剪切方向上是相等的,但相反的,普通和特殊的波陣面(圖4a)和圖4c)),一端非凡的波陣面的棱鏡,提前出現的普通的波陣面,而在相應的位置上的另一端,普通的波陣面射出棱鏡之前的非同尋常的波陣面。


如果剪切軸平行的方向上的渥拉斯頓棱鏡的入射偏振光的波陣面,然后正交分裂的波前將不會(huì )發(fā)生,直線(xiàn)偏振光,會(huì )出現從棱鏡。同樣地,如果入射的偏振光的波陣面的方向垂直于棱鏡剪切軸,它也將出現從棱鏡相對于取向不變。理想的情況下(和所需的微分干涉顯微鏡)發(fā)生時(shí),入射的偏振光的波陣面以45度的角度的棱鏡的剪切軸的取向。電矢量的直線(xiàn)偏振光進(jìn)入從這個(gè)角度一分為二成兩個(gè)分量矢量,每個(gè)振動(dòng)的快或慢的石英晶體軸線(xiàn)的平面,并具有(70.7%)的根均方原來(lái)的波陣面的振幅。兩個(gè)沃拉斯頓和諾馬斯基的棱鏡表現出定向依賴(lài)特性。準直的線(xiàn)偏振光束,在一個(gè)45度角進(jìn)入對面的棱鏡,(這次從頂部)也將產(chǎn)生正交平凡和普通的波陣面。然而,極化波將顛倒過(guò)來(lái)。


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渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡時(shí)被夾在兩個(gè)交叉的偏振器之間,并檢查與透射光通過(guò)兩個(gè)偏振器,棱鏡,平行與一個(gè)主要的中央的黑色帶(邊緣)(圖5中所示),可以觀(guān)察到的干涉條紋的圖案。這些模式的結果之間的斜高亢的普通且平凡的波陣面棱鏡的臉出現的干擾。的外圍邊緣的左側和右側的中央暗干涉條紋,顯示的經(jīng)典偏振干涉色譜的日益增加的訂單。專(zhuān)為物鏡,具有不同的焦距和數值孔徑棱鏡楔切越來(lái)越淺的角度(放大倍率和數值孔徑增加)產(chǎn)生較窄的干涉條紋綁扎。圖5為一系列的固定利用Nomarski棱鏡設計的連續的較高的物鏡的放大倍數(圖中所示)上的右手側示出這個(gè)概念。


如果一階補償器(紅板)被添加到在對角位置(圖5中未示出)的交叉偏振器夾心,被替換為黑色條紋表示減法(黃色)在一邊和另外(藍色的干涉色)原來(lái)的暗條紋的位置的另一側。添加的第二沃拉斯頓或利用Nomarski棱鏡頂部的第一相移補償(以及由此產(chǎn)生的干涉條紋)的第一棱鏡的整個(gè)長(cháng)度上,導致消光(如圖5中所示,注意才能觀(guān)察到,這種影響,如果實(shí)驗有兩個(gè)棱鏡相同的剪切角)。翻譯棱鏡相對于其他橫向均勻的偏置,或路徑長(cháng)度的變化,將被引入,可以觀(guān)察到(圖5)通過(guò)三明治。在一個(gè)方向上滑動(dòng)棱鏡將變暗,然后減輕棱鏡,在另一個(gè)方向上滑動(dòng)的同時(shí),將產(chǎn)生一系列均勻的干涉色(從黃色一階)。


夾在兩個(gè)偏振器之間利用Nomarski棱鏡觀(guān)察到的干涉條紋出現浮在空間上方幾毫米,棱鏡。然而,當相同的條紋被視為使用Wollaston棱鏡,它們似乎在于內部的棱鏡。利用Nomarski和渥拉斯頓棱鏡的干涉條紋的位置被稱(chēng)為干涉平面。因為在傳統的渥拉斯頓棱鏡的干涉平面被定位在棱鏡的中央部,在約中心線(xiàn)之間的楔形件(圖6),它是難以適應沃拉斯頓棱鏡的使用與標準的顯微鏡物鏡。該問(wèn)題是因為棱鏡的干涉平面必須一致,并且重疊的后側焦點(diǎn)面(也稱(chēng)為衍射面)的物鏡,這往往在于以下的玻璃透鏡元件的內螺紋安裝。


大多數制造商規避的物鏡孔徑間隙問(wèn)題通過(guò)采用諾馬斯基(偶爾被稱(chēng)為改性沃拉斯頓)棱鏡聚光鏡物鏡焦平面梁剪切和重組的職責,分別。由于一個(gè)專(zhuān)門(mén)設計的,如下面所討論的,利用Nomarski棱鏡的干涉平面位移到一個(gè)站點(diǎn)以外的棱鏡,而不是在傳統的沃拉斯頓設計的楔形元件跨越幾個(gè)毫米。利用Nomarski棱鏡不要求物理上位于物鏡聚光鏡焦平面,但可以定位一些距離。利用Nomarski棱鏡雖然不產(chǎn)生更好的對比度,它們避免了潛在的問(wèn)題,干涉條紋變得不可見(jiàn)視。應該指出的是徠卡顯微一旦產(chǎn)生一種流行的顯微鏡被稱(chēng)為史密斯的T微分干涉對比系統,其中納入標準的渥拉斯頓棱鏡到特別設計的物鏡。然而,這樣的設計策略是罕見(jiàn)的例外,而不是規則。


利用Nomarski棱鏡,像一個(gè)Wollaston棱鏡,由膠合在一起為斜邊的兩個(gè)光學(xué)石英楔子。楔常規渥拉斯頓石英楔子是相同的,并具有的光軸取向平行于棱鏡表面。然而,修改的第二楔形切割石英晶體,以這樣的方式相對于平坦面的棱鏡的光軸傾斜的方向。當楔塊相結合,形成復合棱鏡的雙折射,在焦平面(和干涉條紋的產(chǎn)生當偏振光通過(guò)棱鏡時(shí))之外的棱鏡板中,如上所述,如圖6所示。產(chǎn)生這種情況的,因為現在的剪切發(fā)生在空氣 石英界面的下楔塊,石英楔之間的界面處的折射導致剪切的波陣面的銜接交叉點(diǎn)以外的棱鏡。利用Nomarski棱鏡焦平面的實(shí)際位置可以調整超過(guò)幾個(gè)毫米的范圍內,通過(guò)改變在第二石英楔子用來(lái)構造棱鏡的光軸的傾斜角度。


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盡管利用Nomarski棱鏡廣泛為物鏡棱鏡,在現代微分干涉相襯顯微鏡,有較少的電容式棱鏡的空間的限制,而這往往是孔徑平面內精確定位。因此,常規的渥拉斯頓棱鏡有時(shí)可以被插入顯微鏡聚光鏡,但在許多情況下,利用Nomarski棱鏡代替。在聚光鏡中被利用時(shí),利用Nomarski棱鏡,棱鏡的設計,以產(chǎn)生干涉平面位于更接近于棱鏡比用于與物鏡構成。其結果是,除了被安裝在具有不同幾何形狀的幀,利用Nomarski棱鏡發(fā)現在現代DIC顯微鏡不同的被切斷,并且是不可互換的??傊?,對于微分干涉顯微鏡,聚光鏡棱鏡(也稱(chēng)為作為次要的,輔助補償的復合棱鏡)作為一個(gè)主剪切分束器的偏振波陣面的物鏡棱鏡(主體棱鏡),而重組的分離波和調節的程度低下之間的平凡和不平凡的波陣面。


重要的是要記住,對準顯微鏡科勒照明是一個(gè)重要和必要的步驟,以確保正確的定位,利用Nomarski棱鏡干涉平面與聚光鏡物鏡的共軛孔徑平面重合。中央,或零階的干涉條紋,這是觀(guān)察時(shí),利用Nomarski棱鏡被放置在交叉的偏振器(如上面所述),可以用于在顯微鏡的取向,以確定正確的方向的棱鏡。


DIC波前關(guān)系和圖像形成


從所述聚光鏡的渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡的孔徑平面出現后,剪切的普通和特殊的相干波陣面聚焦透鏡元件的檢體之前,由物鏡收集聚光鏡和穿越。沿著(zhù)它們的軌跡在聚光鏡物鏡之間保持相互平行地,波陣面分離由來(lái)自聚光棱鏡的幾何約束進(jìn)行的剪切距離。波陣面(剪切的距離)之間的空間距離隨聚光鏡和物鏡的數值孔徑,但現在在0.11.5微米之間的實(shí)際的限制,被設計為稍小于(或等于在某些情況下)的橫向分辨率的線(xiàn)性范圍的物鏡。微分干涉對比分辨率可以增加(在對比度為代價(jià)的)通過(guò)減少剪切距離大約一半的物鏡的最大分辨率。


大多數顯微鏡制造商上的剪切與距離分辨率和對比度權衡妥協(xié),產(chǎn)生棱鏡有一個(gè)最大的剪切距離約0.6微米較低倍物鏡(10倍)下降到最低接近0.15微米的高倍率物鏡(60X100X)。不管剪切距離,然而,重要的是要注意,緊密間隔的波陣面的對,空間上分布在整個(gè)顯微鏡的光圈,樣品試樣的每一個(gè)點(diǎn)在圖像平面上的雙光束干涉,以最終提供。


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當受到檢體的存在下,相干波前對遇到相同的試樣和圖像平面之間的光程差,到達物鏡的后側焦點(diǎn)面,具有相同相位的關(guān)系,當他們離開(kāi)聚光鏡。利用Nomarski棱鏡位于后面的物鏡重組的波陣面在物鏡的焦平面,以產(chǎn)生具有臺下偏振器的透射軸相同的方向電矢量振動(dòng)的直線(xiàn)偏振光。阻止通過(guò)第二偏振片(或分析儀)的偏振器(圖7a)和圖7b)),它具有一個(gè)透射軸取向垂直于退出物鏡棱鏡的線(xiàn)性偏振的波陣面。其結果是,出現在視場(chǎng)中觀(guān)察到的圖像的背景很暗或黑,簡(jiǎn)稱(chēng)為消光的條件。


沒(méi)有試樣引起的相移,聚光棱鏡的光束分離動(dòng)作的精確匹配,逆轉的物鏡利用Nomarski棱鏡最終產(chǎn)生直線(xiàn)偏振光束重組效果。換句話(huà)說(shuō),當在顯微鏡科勒照明(高分辨率微分干涉顯微鏡的重要先決條件)而正確的配置,聚光鏡物鏡的協(xié)同運行,投射圖像到物鏡棱鏡的光源和聚光棱鏡。物鏡利用Nomarski棱鏡,方向反轉相對于聚光鏡棱鏡,介紹了精確地補償由聚光棱鏡產(chǎn)生的波陣面之間的非線(xiàn)性相移的相移。這個(gè)動(dòng)作發(fā)生的所有配對的波陣面在整個(gè)顯微鏡光圈。聚光鏡物鏡棱鏡的軸以45度角度的交叉的偏振器(偏振器和分析器)的透射軸相對于彼此的取向為平行。兩個(gè)棱鏡的取向軸的被稱(chēng)為剪切軸,一個(gè)重要的概念,定義的時(shí)候,他們離開(kāi)聚光棱鏡的普通和特殊的波陣面的軸線(xiàn)之間的橫向間隔,直到它們被由物鏡棱鏡復合到達圖像平面。


波前畸變在發(fā)生相干成對的波陣面遇到標本中存在的相位梯度,而通過(guò)從聚光鏡物鏡,被誘導的波將經(jīng)過(guò)沿剪切方向的相移,并遍歷稍微不同的光路(雖然沒(méi)有變化極化而發(fā)生)。當到達物鏡棱鏡,相移成對的波陣面被重新組合,以產(chǎn)生橢圓偏振光(在相反的直線(xiàn)偏振光,在沒(méi)有制作的標本)。電位移矢量所得到的波陣面,而不再是平面的,掃出一個(gè)橢圓形的通路,因為它穿越的物鏡棱鏡和分析儀(圖7c)中示出)之間的區域。因為分析儀的透射軸平行的橢圓形的波陣面的一個(gè)組成部分,通過(guò)分析儀的波的某些部分,并產(chǎn)生具有有限的幅度和最終能夠產(chǎn)生圖像平面中的強度的平面偏振光。


總之,試樣中的光路梯度引起的相移,在配對的相干波陣面的剪切由聚光棱鏡,通過(guò)對平行的軌跡。這些相移被翻譯成由物鏡利用Nomarski棱鏡的相位差,創(chuàng )建橢圓偏振光,是能夠通過(guò)線(xiàn)性成分通過(guò)分析器創(chuàng )建映像。事實(shí)上,在整個(gè)試樣字段,創(chuàng )建的相位梯度的存在或不存在線(xiàn)性和橢圓偏振的波陣面,有選擇地通過(guò)其振動(dòng)平面的方位角的分析裝置的組合??梢酝ㄟ^(guò)分析儀的波陣面都是平面平行的,并可以產(chǎn)生一個(gè)試樣的振幅圖像,通過(guò)在圖像平面上的干擾。當物鏡棱鏡精確地補償聚光鏡棱鏡(因為它在科勒照明)的影響,分析儀塊的波陣面在源自該字段的所有空間位置的缺乏(沒(méi)有檢體相的梯度)的相移。由此產(chǎn)生的背景是暗視場(chǎng)觀(guān)察(參展總滅絕)的異常陡峭標本折射率或厚度梯度,這似乎更亮(通常以大綱形式)的區域顯示。形象出現的經(jīng)典,簡(jiǎn)單,暗場(chǎng)照明技術(shù)所產(chǎn)生的圖像非常相似。


這些概念被描繪在圖8中,其中提出后通過(guò)相試樣(具有較高的折射率比周?chē)橘|(zhì)中),和它們相應的振幅(或強度)的配置文件在圖像平面的剪切波陣面之間的相位關(guān)系的圖形。相互垂直的波陣面(標記為Σ(1Σ(2) ,請參閱圖8a)),通過(guò)試樣的扭曲,并顯示局部區域的相位延遲(稱(chēng)為差分相位延遲)。的物鏡利用Nomarski棱鏡重組取消引入由聚光棱鏡的角波剪切的波前的波前變形的過(guò)程中產(chǎn)生的橫向位移。波前畸變型材(平凡和普通的組件)在圖像平面重建沿剪切軸線(xiàn)的說(shuō)明在圖8a)在雙棱鏡儀器配置已經(jīng)調整到最大的滅絕。試樣引入的波陣面的相位延遲(φ)表示的剪切軸(x)的浸沿的寬度,而在縱坐標上(以納米為單位)表示放大的試樣直徑(在這種情況下,一個(gè)單一的液滴的油狀物)。


dic intro figure8


在圖8a)的波陣面的相位滯后后已發(fā)送通過(guò)分析器團聚在圖像平面和相消干涉,由此產(chǎn)生的強度分布沿剪切方向(圖8的振幅積可以表示為( b)段)。對于本例中考慮對稱(chēng)的油滴標本,作為剪切軸之間的距離的函數的振幅的積產(chǎn)生暗的兩側是明亮的區域(參見(jiàn)圖8b))的中心空腔。數字圖像的實(shí)際標本在顯微鏡下觀(guān)察(圖8C))顯示明亮的邊緣疊加在黑色的背景和暗干涉條紋帶中心的球形微。圖8中的圖像被記錄在一個(gè)直立顯微鏡光學(xué)系統的配置與DIC。倒立組織培養顯微鏡產(chǎn)生基本相同的結果,但是,中央干涉條紋二等分的半球狀的油滴將定向為垂直于圖圖8c)中所示的那些。


介紹偏置遲緩的


調整最大的滅絕在微分干涉對比顯微鏡,視場(chǎng)呈現一片漆黑,幾乎是黑色的,背景,表現出非常高的靈敏度標本地區,同時(shí)具有增加和減少相梯度。圖圖8c)中所示,一些標本細節模糊或非常困難的,以解決在此配置中,可以遍歷突出的特點(diǎn),常??梢杂^(guān)察到的干涉條紋的零級。在實(shí)踐中,物鏡利用Nomarski棱鏡沿剪切軸的橫向偏移量,均勻地轉移通過(guò)試樣的普通和特殊的波陣面的相對的相位位移。因此,從物鏡棱鏡出現的光的偏振矢量方向可以調整,從線(xiàn)性到各種程度的橢圓形,甚至圓形。相對于普通的波陣面的相位移的轉移的非凡的波陣面通過(guò)翻譯的物鏡棱鏡通常被稱(chēng)為偏置相位差DIC的顯微鏡的介紹。


物鏡利用Nomarski棱鏡橫向移動(dòng)(或者左側或右側的顯微鏡的光學(xué)軸),波前對背景越來(lái)越滯后的相位與相對于彼此。其結果是,在進(jìn)入分析儀的波陣面的橢圓偏振的程度增加,背景強度逐步轉換從黑到介質(zhì)和較輕的灰色陰影。此外,引入的偏置相位差的變化的零級干涉條紋的位置,并產(chǎn)生相應的變化,在該樣本中的相位梯度的強度水平。這些取向依賴(lài)目前較亮的背景顏色通常被稱(chēng)為零階灰度明亮的區域和黑暗的陰影疊加產(chǎn)生的結果。最終DIC圖像不依賴(lài)于被引入完全通過(guò)翻譯的物鏡棱鏡的光程差,并沿顯微鏡光軸聚光棱鏡時(shí),可以得到相同的結果。然而,在大多數儀器,它是更為方便的產(chǎn)生偏置相位差,通過(guò)移動(dòng)的物鏡的位置,而不是安裝在聚光鏡中的炮塔的棱鏡的棱鏡。


通過(guò)改變偏置相位差引入到試樣發(fā)生亮度梯度沿剪切軸的聚光鏡物鏡棱鏡,一般出現源自以45度角(西北部到東南或反之亦然)時(shí),觀(guān)察到的試樣目鏡(參見(jiàn)圖8f)條)。請注意,在圖8中所示的梯度(六)被記錄,與一個(gè)正立顯微鏡。倒置顯微鏡生產(chǎn)強度梯度,面向垂直直立顯微鏡中觀(guān)察到的那些。在一個(gè)方向或另一個(gè)會(huì )影響干涉條紋偏移和改變普通和非凡的波陣面之間的相位關(guān)系(智障或高級),從而扭轉了陰影投在試樣方向移動(dòng)棱鏡。


引入偏置相位差的凈結果是使試樣在偽三維浮雕圖像增加光程差(傾斜的相位梯度)的區域出現明亮的(或暗),和那些表現出路徑長(cháng)度減小出現在反向。試樣的功能出現類(lèi)似的高原升高或凹陷的凹部,根據相位梯度方向,這是一個(gè)顯著(zhù)特征的微分干涉對比。然而,三維外觀(guān)只對應相梯度,不應該被混淆與實(shí)際試樣的幾何形狀(如過(guò)于頻繁的情況下)。在某些情況下,實(shí)際的地形特征也是不斷變化的相位梯度的網(wǎng)站,但作為獨立的調查的結果,獲得的信息的情況下,這個(gè)事實(shí)不應假定。


在微分干涉顯微鏡的偏置相位差簡(jiǎn)介圖圖8d)中示出通過(guò)圖8f)就組成的多個(gè)半球狀的油滴的相位標本。當在顯微鏡調整最大消光,顯示普通和特殊的波陣面沿剪切方向的相移,但不表現出背景的對應的區域(圖8a))的相位差。翻譯的物鏡棱鏡的偏置相位差此外一個(gè)波陣面之間的相對相位移位相對于其他的(圖圖8d)),但保持相同的波陣面的剪切。干擾的像面,產(chǎn)生的振幅(或強度)的積,作為剪切距離的函數(圖圖8e))后,顯示一個(gè)明亮的邊緣區域的一側上的油滴和暗區域的相對側上。在顯微鏡中觀(guān)察時(shí),試樣顯示出陰影鑄態(tài)的外觀(guān),就好像它是從一個(gè)高度傾斜的角度(參見(jiàn)圖8(六))照射。為了觀(guān)察最大消光之間的差別,除了偏置相位差,比較試樣圖像呈現在圖圖8c)及(f)。的陰影的方向,這是依賴(lài)于剪切軸(圖8中的(c)和(f)段),在相反的方向上按相同的量的物鏡棱鏡翻譯可以扭轉的雙頭箭頭。


偏置已翻譯物鏡利用Nomarski棱鏡沿著(zhù)光軸來(lái)回使用微調旋鈕位于端的安裝框(通常放置在顯微鏡的物鏡轉換器殼體或中間管)引入傳統的微分干涉差顯微鏡。一種替代技術(shù),這是日益深入人心,是四分之一波長(cháng)相位差板的安裝在固定的方向之間的偏光器和聚光鏡的棱柱(稱(chēng)為Sénarmont DIC補償)。最大消光,相位差板的快軸與偏振器的透射軸對齊,兩個(gè)光學(xué)單元可以是(往往都是)的基礎上,在顯微鏡的同一殼體內包含。去Sénarmont補償器的備用位置,在顯微鏡配備適當的中間管的物鏡棱鏡和分析儀之間。


為了使引入的偏置使用去Sénarmont補償器,偏振器的透射軸旋轉(加或減45度)的相位差板,保持固定在一個(gè)90度角相對于分析儀的快軸相對于傳輸軸。當補償器的快軸相一致(平行)與偏振器的透射軸,只有直線(xiàn)偏振光通過(guò)通過(guò)去Sénarmont補償器的聚光棱鏡。但是,當偏振器的透射軸旋轉時(shí),從四分之一波長(cháng)的相位差板的過(guò)程中出現的波陣面成為橢圓偏振光。旋轉偏振器在一個(gè)方向上會(huì )產(chǎn)生右撇子的橢圓偏振光,旋轉的同時(shí)在另一個(gè)方向上的偏振器將改變矢量軌跡生成一個(gè)左手系的橢圓掃描。


dic intro figure9


當起偏器的透射軸的方向達到無(wú)論是加或減45度(相等于四分之一波長(cháng)的相位差),補償器的光通過(guò)圓偏振光(再次在任何一個(gè)慣用左手或右手的意義上)。因為橢圓或圓偏振光代表的普通和特殊的新興的從去Sénarmont補償的波陣面之間的相位差,偏置引入到系統的波前進(jìn)入聚光鏡棱鏡和剪切。正偏壓時(shí),得到的偏振片在一個(gè)方向上旋轉,而通過(guò)在相反的方向旋轉偏振器引入負偏壓。


不管偏置是否被引入到翻譯的物鏡利用Nomarski棱鏡或旋轉的偏振片上解Sénarmont補償由一個(gè)微分干涉對比系統,最終結果是相同的。正如前面討論的,在一個(gè)正確配置的顯微鏡,科勒照明,圖像的光源和聚光棱鏡是由光學(xué)系統(聚光鏡物鏡)轉移到位于上面的物鏡的后側焦點(diǎn)面倒立的第二利用Nomarski棱鏡對準。整個(gè)面部的聚光棱鏡的線(xiàn)性相移被精確地補償由一個(gè)相反的相移在物鏡棱鏡。翻譯的物鏡棱鏡沿剪切方向不改變的相移分布,而是,添加或減去一個(gè)恒定的相位差在整個(gè)顯微鏡的光圈。旋轉在去Sénarmont補償偏振器中相同的方式,還引入了一個(gè)變量,并控制相位差。匹配的棱鏡系統使圖像形成發(fā)生與每一個(gè)波前對投影來(lái)自聚光鏡的孔徑相同的偏置電壓的相位差,不論路由通過(guò)它穿過(guò)試樣到達物鏡。


如圖9所示的是一系列的數字圖像記錄在DIC使用偏置在一些中間步驟中的二十分之一到四分之一波長(cháng)的相位差范圍。樣品是15微米邊的固定和安裝小鼠小腸包含波動(dòng)厚度的區域。的試樣細節和陰影鑄的偽三維效果是最顯著(zhù)的在較低的偏置相位差值(圖9a)和圖9b)),但細標本細節的對比度和清晰度都惡化,作為偏置相位差的移交增加(圖9c)到9f)條)。在偏置遲緩最高值(四分之一波長(cháng);9F)),對比度極差,極少數的結構細節可見(jiàn)。對于這個(gè)特殊的試樣,最佳相位差范圍介于的二十分之一的波長(cháng)的十二分之一。


作為光路梯度增加的標本,因此圖像對比度。改變偏置相位差在不同程度上也可以產(chǎn)生顯著(zhù)的對比目鏡(圖9)中所觀(guān)察到的試樣中的波動(dòng)。在一般情況下,誘導的翻譯的物鏡棱鏡,或通過(guò)旋轉在去Sénarmont補償偏振器之間的普通和特殊的波陣面的位移,是最佳的程度上的順序小于十分之一波長(cháng)。但是,該值是在很大程度上依賴(lài)于試樣的厚度,有用的范圍的生物樣本的偏置相位差之間的三十分之一和四分之一波長(cháng)。對比標本中具有非常大的光學(xué)梯度往往可以受益于更大的偏置相位差值(全波長(cháng))。成一個(gè)微分干涉對比顯微鏡使偏置遲緩階段更容易被觀(guān)察的標本,并與傳統的膠片或數碼相機系統,極大地方便了成像努力。


DIC顯微鏡補償遲緩板


偏置微分干涉對比普通和特殊的波陣面之間的相位差,也可以通過(guò)使用最初的物鏡作為定量的相位差測量裝置和偏振光顯微鏡的對比增強元素的補償操作。補償板賦予更大的控制,用于調整試樣的細節的對比度有關(guān)的背景強度和顏色值中,并且也能夠更精確地調整的波陣面之間的偏差值。這些雙折射元件也經(jīng)常采用的光學(xué)透明的標本的染色,通常呈現在有限范圍內的灰度值。


當一個(gè)標準的物鏡利用Nomarski棱鏡翻譯顯微鏡沿光軸的四分之一波長(cháng),這兩種試樣的功能,并獲得一個(gè)頻譜牛頓干涉色偏振光顯微鏡中觀(guān)察到的相似的背景之外的路徑差。試樣和背景的顏色過(guò)渡,通過(guò)一系列的灰度值,通過(guò)白色,黃色,紅色,藍色和高階遷移變得光染色。光學(xué)染色產(chǎn)生的戲劇性和精美的彩色圖片,但對科學(xué)應用的用途有限。通常情況下,最佳的標本的對比被限制到二十分之一到四分之一波長(cháng)的相位差的范圍內。


補償器可以插入到物鏡棱鏡和分析儀或偏振器和聚光鏡棱鏡之間的DIC顯微鏡的光學(xué)路徑。許多顯微鏡在中間管或為此物鏡而設計的臺下聚光器殼體有一個(gè)插槽。另外的一階補償器(通常稱(chēng)為全波一階的紅色板)具有等于全波長(cháng)的可見(jiàn)光(約550納米),綠色區域中的延遲值,引入了頻譜的干涉色檢體和背景。與補償器代替,綠色光無(wú)法通過(guò)分析儀,因為它從與偏振器的電場(chǎng)矢量具有相同的方向的線(xiàn)偏振光的相位差板。然而,在紅色和藍色光譜區域的波陣面發(fā)生相位差小于一個(gè)波長(cháng),成為橢圓偏振光,使他們能夠通過(guò)分析器傳遞組件。其結果是,這些顏色混合形成的視場(chǎng)中的品紅色的背景。


因此,當試樣中觀(guān)察到的白色光微分干涉對比光學(xué)系統和一階補償,背景顯示品紅色,而在將顯示在二階的藍色和黃色的顏色的一階(視方向而定)的圖像的對比度牛頓干涉色譜。補償到位的翻譯諾馬斯基棱鏡(或旋轉偏光鏡在一個(gè)Sénarmont補償),具有大光學(xué)相位梯度結構中觀(guān)察到的干涉色產(chǎn)生快速變化,小的變化獲得偏置遲緩的。這種技術(shù)是有用的顏色(光染色)引進(jìn)具有高折射率的界限,如細胞膜,細胞內顆粒大,纖毛和細胞核的地區。標本功能顯示的干涉色,可以比較在米歇爾征收的比色圖表獲得的估計值的光程差的值。


dic intro figure10


在圖10中示出幾個(gè)透明的標本已光學(xué)染色,呈現在偽三維浮雕通過(guò)DIC的光學(xué)技術(shù)。圖10a)示出口的犬鉤蟲(chóng)(犬鉤蟲(chóng)),而圖10b)的特點(diǎn)是在突起的邊緣處的櫛魚(yú)鱗。圖10(三)大,豹紋蛾(Ecpantheria scribonia)的七彩翅膀上的鱗片。在所有情況下,利用Nomarski棱鏡被翻譯通過(guò)顯微鏡光軸的偏置相位差值,該值超過(guò)全波長(cháng)。雖然這些圖像不顯示隱藏的科學(xué)信息有關(guān)的標本,他們這樣做有可能提前DIC的光學(xué)顯微鏡技術(shù),作為一個(gè)合法的科學(xué)和藝術(shù)之間的橋梁。


開(kāi)成一個(gè)微分干涉對比光學(xué)系統引入偏置與解Sénarmont補償顯微鏡配備一個(gè)全波的相位差板可以被添加到光學(xué)染色試樣與牛頓的干涉色,并提供更多的定量信息的路徑差。如上所述,Sénarmont補償經(jīng)常采用DIC的顯微鏡取得的偏置相位差的精確測量的水平,但該設備也是有用的,監視對應的光學(xué)組件。在視頻的增強型DIC的顯微鏡,去Sénarmont補償往往利用優(yōu)化對比度標本細節在于顯微鏡的分辨率極限以下。


DIC圖像的解釋


其中最顯著(zhù)和廣受認可的微分干涉對比顯微鏡獲得的圖像方面是高度可見(jiàn)的浮雕,表現通過(guò)賦予偽三維寫(xiě)實(shí)的陰影投效果。在一般情況下,標本出現,通過(guò)光從低角度與高度傾斜的光源,讓人聯(lián)想得到的結果與傳統的斜照明或霍夫曼調制對比。然而,謹慎,圖像應始終被解釋與理解的陰影和高光的影子投引渡相或光學(xué)路徑漸變指示標志和坡向,不一定透露精確的幾何或地形參數。


從觀(guān)察在幾乎每一個(gè)產(chǎn)生的圖像通過(guò)偏置相位差的陰影鑄造定向本,光學(xué)剪切方向是明顯的,可以精確地定義為顯示的最高和最低亮度值的區域的軸線(xiàn)連接。應考慮的另一個(gè)考慮因素是檢體之間的關(guān)系及其周?chē)橘|(zhì)中,因為陰影的方向通常相反試樣具有較高或較低的折射率比周?chē)脑敿毿畔?。其結果,致密的亞細胞顆粒,如細胞核,核仁,線(xiàn)粒體,細絲,中期染色體,,溶酶體通常顯示提出的海拔(小山頂)的外觀(guān),而較低折射率的夾雜物(例如,吞飲小泡,水空泡,脂滴)似乎是凹陷的凹部(凹)。


檢體相梯度(偽立體感的程度)的微分干涉對比賦予的對比度電平是翻譯諾馬斯基棱鏡或旋轉偏振器去Sénarmont中的,由該光學(xué)系統引入的量的偏置相位差的函數補償器。因為利用Nomarski和渥拉斯頓棱鏡的設計和其他約束涉及微分干涉對比的波陣面取向的剪切軸是固定的,不能被改變的軸線(xiàn)方向上影響標本的對比,通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的顯微鏡上的設置。然而,普通和非凡的波陣面之間的相對相位延遲是可以逆轉的搬遷物鏡棱鏡,從一個(gè)側面顯微鏡的光學(xué)軸(偏置遲緩轉移由負轉正,或反之亦然)。此操作也可以通過(guò)旋轉偏振器上去Sénarmont的補償器的相應的負值。當相位延遲被改變如剛才所述,在試樣上的亮區和暗邊的方向扭轉180度。在本質(zhì)上,可改變相對于試樣的剪切軸的顯微鏡的唯一機制是為調整試樣本身的一種手段,有利于從圓形360度可旋轉的階段(設計主要是為偏光顯微鏡)的利用率。


在微分干涉對比度的圖像,陰影和高光強度是最大的沿剪切軸的顯微鏡,和恒定的折射率的顯示亮度值是相同的背景區域的。當檢查的試樣具有球形的幾何形狀(圖8f)條)從幾個(gè)方位接壤的背景邊緣的對比度,它被發(fā)現是最小的對比度區域中垂直于剪切軸。事實(shí)上,試樣和背景之間的對比度差異逐漸減小,直到他們到達定義的零級干涉條紋(垂直于剪切軸)的軸線(xiàn)的方向中的最小值。在圖8c)和圖8f)中的試樣表現出最低級的對比度(無(wú)標簽的白色箭頭指示的)的區域,在中心區的邊緣正好垂直于剪切軸的油滴。為了驗證這個(gè)概念,比較干涉條紋滿(mǎn)足的背景圖像中的記錄,可在最大消光(圖8c)條)的偏置相位差引入后生成的圖像中的相應區域的邊緣(圖8f) )。無(wú)標簽的白色箭頭標記的區域,普通和特殊的波前畸變對齊的配置文件,減去取消剩余遲緩和屈服強度值完全匹配的背景分析儀。


在微分干涉顯微鏡檢查每個(gè)試樣將有一個(gè)最佳的偏置相位差設定在最終圖像中產(chǎn)生最大的對比度水平。非常薄的試樣顯示一個(gè)淺的折射率梯度,如活細胞的培養,一般可使用同樣低的偏置設置僅稍大于最大的相移標本中存在(約一個(gè)波長(cháng)的二十分之一的順序,或約30納米)。然而,較厚的標本往往需要較高的偏置設置(四分之一波長(cháng))大型聚光鏡孔產(chǎn)生令人滿(mǎn)意的結果,通常是通過(guò)光學(xué)切片。因為許多試樣組成的功能,顯示的各種不同的尺寸和折射率,最佳偏置相位差設置通常是一種妥協(xié)。


方位角微分干涉對比一些試樣的取向現象的影響列于圖11。在所有情況下,剪切軸指向西北向東南,但并不表示對個(gè)人的數字圖像。圖11a)和11b)示出的毛孔及皮紋所表現出的安裝來(lái)自硅藻布紋attenuatum frustule周期間距。當長(cháng)軸的frustule的取向垂直于剪切軸(圖圖11a)),毛孔合并成一系列緊密間隔的脊,單獨都沒(méi)有解決。與此相反中,剪切軸平行的方向上重新定位frustule揭示的旋鈕狀的幾何形狀的孔結構在這樣的物種。


dic intro figure11


含鰓排骨淡水水蚤(水蚤),圖11(三)胸部區域。在該取向中,各個(gè)肋結構都清晰可見(jiàn)(垂直于剪切軸線(xiàn)),并連接到一個(gè)共同的脊椎,顯示為剪切軸線(xiàn)平行的一長(cháng)系列的旋鈕。當試樣旋轉90度(圖第11d)),許多肋結構失去對比度,脊髓旋鈕合并成一個(gè)單一的脊。最后,夾雜物在櫛魚(yú)鱗缺乏對比度和疊加在紋狀體棘(圖11E))時(shí),很難區分。試樣的旋轉帶來(lái)的的棘平行剪切軸(圖11f)條),它們的對比度降低,使夾雜物清晰可見(jiàn)。


許多因素時(shí),應考慮調整偏置遲緩,產(chǎn)生最佳標本的對比。水平偏差,必須引入最大限度地變暗一個(gè)斜坡或試樣邊緣也產(chǎn)生最大可能的試樣和背景之間的對比度。因此,對于每一個(gè)標本,一個(gè)特定的物鏡棱鏡(或取消Sénarmont的補償器)設置通常會(huì )引入最大程度的對比。超過(guò)此值時(shí),對比度會(huì )降低。較厚的標本,經(jīng)常遭受來(lái)自光散射文物,通常需要一個(gè)更大的偏置遲緩設置(全波長(cháng))比薄的標本獲得具有顯著(zhù)的階段梯度地區滅絕。最后,當在聚光鏡中的可變光闌開(kāi)口尺寸超過(guò)75%的物鏡后孔,減少過(guò)多的在光學(xué)系統中的光散射的結果對比。隨著(zhù)這個(gè)困難時(shí),請小心打開(kāi)聚光鏡光圈以執行光學(xué)切片實(shí)驗。


光學(xué)切片


大型聚光鏡和物鏡的數值孔徑的微分干涉對比標本圖像的能力,能夠創(chuàng )造顯著(zhù)的淺光從一個(gè)集中的圖像部分。如果沒(méi)有光暈和側面去掉從焦點(diǎn)從明亮區域分散注意力的強度波動(dòng)的干擾,該技術(shù)得到銳利的圖像,都整齊地從復雜的三維相位標本切片。此屬性通常利用取得清晰的輪廓,在復雜的組織細胞的光學(xué)部分的焦平面上的上方和下方的結構以最小的干擾。


在所有傳統形式的透射和反射的光鏡,孔徑光闌聚光鏡發(fā)揮了重要作用,定義圖像的對比度和分辨率。產(chǎn)生增強的對比度的同時(shí),減小光圈的大小字段和整體圖像的清晰度增加了深度。但是,如果隔膜被關(guān)閉太多,衍射工件變得清楚和分辨率犧牲。通常情況下,最佳的光圈設置是準確地渲染足夠的對比度和保留圖像分鐘功能需要的分辨率,而避免衍射文物的標本細節之間的一種折衷。


高性能的微分干涉差顯微鏡的光學(xué)系統與聚光鏡部分閉合的可變光闌(約70%的物鏡后的光圈大?。┊a(chǎn)生優(yōu)異的對比度,而且還當膜片被打開(kāi)以與物鏡孔徑大小相匹配性能極佳。為了實(shí)現光學(xué)切片分辨率和對比度之間的最佳平衡,必須正確地配置在顯微鏡科勒照明棱鏡元件和偏振器應精確對準。高數值孔徑物鏡設計用于浸油只應利用圖像試樣滑動(dòng)到聚光鏡的底部的油。


在高放大倍率和數值孔徑(例如,100倍和1.4),微分干涉對比景深接近一個(gè)限制值,約400納米(0.40微米,約1.5倍的橫向分辨率極限的物鏡)。通過(guò)一個(gè)人口腔上皮細胞在高放大倍率(100倍物鏡)和數值孔徑(1.30)的中央區域所拍攝的圖12中所示的光學(xué)部分。該單元格是約3微米厚的附近的細胞核中,利用取得的圖像在圖12中為約0.5微米的配置和景深。細菌是清晰可見(jiàn)的單元格(圖12a))的上表面上,是平行的,在膜旋轉脊非常相似的手感的人的指紋。甲隆起對應于細胞核膜在較低的中央部的圖中也可看到。當焦平面被轉移到細胞內部(圖12b)條),核結構和細胞內顆粒變得可見(jiàn)。最后,在細胞膜放在顯微鏡載片上的表面(圖圖12c))的下邊界,揭示許多折疊脊(的上表面上所觀(guān)察到的相似)。


dic intro figure12


當執行用較厚的生物標本(特別是那些在水溶液中的鹽溶液浸漬)的光學(xué)切片實(shí)驗時(shí),必須警惕的顯微鏡蓋玻片和安裝介質(zhì)之間的界面處的折射率不連續所產(chǎn)生的球面像差的可能引入。這些項目將降低分辨率的光學(xué)部分系列更高的穿透深度。


當前甲顯著(zhù)量的微分干涉對比理論的研究和開(kāi)發(fā)集中在引人注物鏡光學(xué)切片的技術(shù)特征。最終,從標本的三維折射率分布圖的定量估計,可以實(shí)現通過(guò)計算模型。此外,目前的研究還沖著(zhù)新車(chē)型正在開(kāi)發(fā)的部分相干的透射光DIC的光學(xué)元件和圖像形成。


結論


微分干涉顯微鏡基本上是作微小的,一般的艾里斑的直徑稍小于剪切系統,在該系統中,將參考光束的光束剪切干涉。事實(shí)上,在該樣本中的每一個(gè)點(diǎn)所代表的兩個(gè)重疊的在最終圖像中,一個(gè)明亮,其他比背景暗的艾里磁盤(pán)?;镜娘@微鏡系統,首先由Francis史密斯1955設計,是修改后的兩個(gè)渥拉斯頓棱鏡附加的,一個(gè)聚光鏡的前焦面和第二物鏡的后焦平面的偏光顯微鏡。


后來(lái)的修改,建議由喬治利用Nomarski,使棱鏡相差的光學(xué)孔徑共軛平面在物理上位于。聚光鏡棱鏡將每個(gè)成兩個(gè)稍微移位,相對于彼此是正交偏振的平行光束,照射試樣,而物鏡棱鏡用于重新組合的光束的波陣面。鏡像到另一個(gè)由光學(xué)系統,這兩個(gè)棱鏡的組合,是在高數值孔徑的微分干涉對比,以形成銳利的圖像的能力的一個(gè)重要特征。


用梯度的幾何路徑長(cháng)度或試樣的折射率,這會(huì )導致在橢圓偏振光的合成光,退出物鏡Wollaston棱鏡被引入到兩個(gè)正交波陣面的相位差。偏置相位差可以被引入到系統翻譯的物鏡棱鏡沿顯微鏡光軸或通過(guò)四分之一波長(cháng)板的偏振器或分析儀相結合。因此,通過(guò)簡(jiǎn)單的旋轉控制旋鈕,可以得到最佳的對比度,場(chǎng)亮度和靈敏度。


由此產(chǎn)生的DIC圖像具有陰影鑄態(tài)的外觀(guān),有效地顯示為低和高的空間頻率的光學(xué)路徑的梯度。這些試樣的光路的區域增加沿基準方向顯得更亮(或暗)的區域出現在路徑差減少,而以相反的對比度。陡峭的梯度光程差導致較大的反差。各種各樣的標本與微分干涉相襯成像是很好的候選人,包括非常薄的細絲或尖銳的接口,從而產(chǎn)生良好的對比度,甚至當他們的直徑低于光學(xué)系統的分辨率極限。


其中主要的微分干涉對比顯微鏡的成像優(yōu)勢是較小的標本特征的形象,不像暗場(chǎng)或相襯,沒(méi)有遮擋相鄰的地區,具有較大的光學(xué)梯度。此外,中性灰色的背景上顯示的圖像的陰影鑄造,耦合到成像非常小的特征,連同那些大得多的靈敏度(例如,分鐘附屬物活細胞或動(dòng)態(tài)的夾雜物在細胞內的細胞器和移動(dòng))傳統相襯技術(shù)是一個(gè)重大改進(jìn)。這些好處,除了對比度控制寬動(dòng)態(tài)范圍和淺景深,都促成了該技術(shù)的廣泛普及。


對比度在DIC的顯微鏡是有方向性的,表現出最大沿剪切的軸線(xiàn)和在正交方向最少。艾里斑分離(平均峰-峰的分離磁盤(pán)半徑的二分之一到三分之二)的方向與剪切軸的顯微鏡,它是最大對比度的方向相一致。其結果是,DIC對比度傳遞函數(CTF)也是方向沿著(zhù)剪切軸。通過(guò)試樣的兩個(gè)波陣面之間的橫向位移大約一半的物鏡的分辨率極限。這種小程度的剪切力,誘導,由渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡類(lèi)似的行動(dòng),一個(gè)高通濾波器的空間頻率的對比度細節在試樣。相應的調制傳遞函數(MTF)緊跟在明照明的高空間頻率觀(guān)察,但樣品的功能,超過(guò)幾個(gè)微米大?。臻g頻率較低)顯示急劇下降。


適合在DIC的觀(guān)察標本包括液涂片檢查,活細胞培養物,血細胞,亞細胞器,未染色的組織,染色體,原生動(dòng)物,胚胎,硅藻,聚合物,副本,以及比較厚的超薄切片。更多信息可以通過(guò)檢查振幅和相位幅度混合標本,如天然色素原生生物,藻類(lèi)和淡染的組織學(xué)標本。該技術(shù)通常是組合使用,以顯示細胞形態(tài)與熒光區域熒光顯微鏡。當耦合增強的視頻技術(shù)(稱(chēng)為VEC-DIC視頻增強的對比度微分干涉對比),DIC可以被用來(lái)產(chǎn)生結構,具有以下的尺寸的顯微鏡的光學(xué)分辨率的圖像。





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