尼康顯微鏡:EPI-熒光照明光路

2020-09-04 09:57:21

直到最近,熒光照明是一個(gè)選項僅適用于配備專(zhuān)門(mén)的高數值孔徑物鏡的研究級復合顯微鏡。這一技術(shù)在立體顯微鏡的需要不斷升級與引進(jìn)的編碼基因和生物特異性熒光蛋白GFP(綠色熒光蛋白)等。


stereo fluorescence figure1


體視顯微鏡的應用GFP觀(guān)察現在是如此普遍,立體聲熒光照明,更經(jīng)常被稱(chēng)為GFP照明,即使他們可以利用許多其他應用在生命科學(xué)和電子制造業(yè)。大幼蟲(chóng),線(xiàn)蟲(chóng),斑馬魚(yú),卵母細胞和成熟的昆蟲(chóng)標本,如可以方便地選擇和操作時(shí),他們GFP標記的照亮熒光技巧。熒光照明揭示生物體產(chǎn)生熒光蛋白耦合到一個(gè)大領(lǐng)域的視野和充足的工作距離和立體視覺(jué),使觀(guān)察員進(jìn)行實(shí)驗,用鉗子,移液器,或顯微操作。其他更傳統的標本也很容易觀(guān)察和記錄使用立體顯微鏡熒光照明。

 


落射熒光照明功能的方式是類(lèi)似上采用更復雜的復合顯微鏡體視顯微鏡上。通常情況下,在熒光照明器由包含在經(jīng)由中間管(或垂直照明,其安裝到顯微鏡外部燈箱的氙燈或汞弧燈,見(jiàn)圖12)之間的的顯微鏡放大本體和觀(guān)察管定位。目前僅限于這種類(lèi)型的照明采用共同的主要物鏡CMO)立體顯微鏡的應用,因為它不是可以使用的市售的零件,以適應一個(gè)的格里諾或聚光型體視顯微鏡熒光照明。

 


弧燈產(chǎn)生的光被引導通過(guò)一個(gè)可調節的聚光透鏡的組合過(guò)濾器塊(圖2和圖3中示出),它允許唯一的光具有特定波長(cháng)范圍內(或帶通),通過(guò)容納在激發(fā)濾光片。過(guò)濾的光,然后通過(guò)顯微鏡成像的下部的顯微鏡(放大的身體和客觀(guān)的在體視顯微鏡)的路徑和到標本偏轉,也調諧到選擇性地過(guò)濾由二色鏡,反射,和/或發(fā)送一個(gè)特定的波長(cháng)區域設置。的術(shù)語(yǔ)二色性(或二色性)是指過(guò)濾器或反射鏡的能力來(lái)區分兩種顏色的范圍,超過(guò)該限制反射特定波長(cháng)極限以下的顏色,而這些波長(cháng)發(fā)送。


stereo fluorescence figure2


聚焦的激發(fā)光通過(guò)顯微鏡放大主體和物鏡,在那里形成一個(gè)倒錐形的照明,沐浴試樣,令人興奮的任何存在的熒光基團,并且有對應的激發(fā)波長(cháng)的帶通范圍內的吸收帶的。二次熒光發(fā)射(通常比的激發(fā)光更長(cháng)的波長(cháng))從試樣發(fā)出的捕捉體視顯微鏡的常見(jiàn)的主要物鏡,并通過(guò)放大機構和阻擋濾波器直接回,塊激發(fā)波長(cháng),并只允許一個(gè)選定的區域發(fā)射波長(cháng)通過(guò)。在圖1和圖2中的顯微鏡體管構成,波長(cháng)較長(cháng)的熒光發(fā)射光通過(guò)左側和右側的放大光信道傳遞到達落射熒光照明器之前獨立地集中。光從左邊的通道直接穿過(guò)屏障過(guò)濾器前觀(guān)察管或直接進(jìn)入到相機端口。與此相反,右聲道的光從第一行駛回然后通過(guò)二色鏡的屏障過(guò)濾器和目鏡。此燈不到相機端口的途徑,只能用于觀(guān)察標本。

 

列于圖23的熒光過(guò)濾器的組合塊的結構細節。每個(gè)塊包含一個(gè)單一的激發(fā)濾光器,兩個(gè)屏障過(guò)濾器和一個(gè)二色鏡。汞弧燈產(chǎn)生的光通過(guò)激發(fā)濾光片進(jìn)入塊,如上所討論的,圖3中所示的二色性反射鏡的表面被反射。次級熒光發(fā)射通過(guò)阻擋過(guò)濾器。激發(fā)光濾光片,二色鏡,用于左聲道的屏障過(guò)濾器粘到的地方,但是,用于右聲道的屏障過(guò)濾器被安裝在一個(gè)小的幀可以通過(guò)擰松固定螺釘的一組從塊中刪除。卸下屏障過(guò)濾器框架允許訪(fǎng)問(wèn)定位在過(guò)濾器內的塊的二色鏡。當粘合成塊,更換過(guò)濾器小心,不要蔓延到過(guò)濾器表面的膠水和不持有的過(guò)濾器或雙色鏡用沒(méi)戴手套的手,以避免污染的表面油膩指紋。

 

熒光垂直照明可以容納三濾的塊和一個(gè)直徑過(guò)濾虛擬塊(沒(méi)有過(guò)濾器),使正常的明場(chǎng)觀(guān)察。過(guò)濾器塊被安裝在滑動(dòng)架中,并且可以被插入到光路中,是用來(lái)控制齒條位置的桿通過(guò)。每個(gè)塊都有一個(gè)附帶的識別板,其可插入順序排列,以使操作者能夠容易地選擇適當的塊,用于熒光觀(guān)察的照明裝置的外部殼體上的插槽。


stereo fluorescence figure3


目前,尼康提供一個(gè)適度的過(guò)濾器組合的陣容,這是表1中列出。這些過(guò)濾器涵蓋了廣泛的熒光激發(fā)和發(fā)射條件,應該是有用的許多普遍使用的熒光探針在生物學(xué)研究。該過(guò)濾器的組合,也適用于工業(yè)應用,如熒光照片污染集成電路晶片檢查抗蝕劑聚合物。激發(fā)波長(cháng)介于380510納米熒光探針,可以用來(lái)選擇合適的激發(fā)/發(fā)射過(guò)濾器組合(見(jiàn)表1)。該過(guò)濾器的組合也是非常有用的研究,采用各種綠色熒光蛋白的突變體,包括青色和藍色的版本。

 

在活的細胞培養物,具有熒光蛋白標簽,可以顯著(zhù)提高的信號強度,過(guò)濾器的組合時(shí),是嚴格匹配的熒光激發(fā)和發(fā)射的檔案。例如,在DS-紅信號,視覺(jué)和圖像傳感器檢測到的紅色熒光的情況下,可以顯著(zhù)提高的紅色信號通過(guò)轉移更多的橙色發(fā)射。此外,專(zhuān)為植物標本具有強烈的自體熒光背景葉綠素排放的過(guò)濾器組合往往受益于仔細和精確的選擇過(guò)濾器的規格,就到相應的信號發(fā)射。顯微鏡工程師采取許多這些設計標準時(shí)考慮到他們正在優(yōu)化波長(cháng)帶通過(guò)濾器組合體視顯微鏡地區。

 


體視顯微鏡熒光濾光片組合


設置過(guò)濾器


激發(fā)
波長(cháng)范圍


二向色鏡


發(fā)射
波長(cháng)范圍


藍綠色熒光蛋白/ DAPI


379-401納米


420納米(DCLP


435-485納米


青色(EGFPGFP


426-446納米


455DCLP


460-500納米


賦予GFP帶通


HQ 450-490納米


Q 495LP


500-550納米


賦予GFP長(cháng)通


HQ 450-490納米


Q 495LP


500納米(LP


TRITC(紅色熒光蛋白)


HQ 530-560納米


Q 570LP


590-650納米


黃綠色熒光帶通濾波器


HQ 490-510納米


Q 515LP


520-550納米


1

 


組合塊過(guò)濾器和其它敏感的干涉濾光片,將隨時(shí)間而變質(zhì)時(shí)暴露在高強度的光,紫外線(xiàn)的波長(cháng)。作為帶通頻率和傳輸值的特性,例如,如果過(guò)濾器被暴露于高濕度條件下也可能受到影響。為了增加這些過(guò)濾器的使用壽命,他們應該被儲存在干燥器中或含有干燥劑的密封容器中。另外,還可減少光通過(guò)過(guò)濾器的保持照明快門(mén)關(guān)閉標本時(shí)不被直接觀(guān)察或用數碼或膠卷的照相機系統成像的時(shí)間量。該過(guò)濾器只應用干燥空氣清潔從耳氣球,軟駝刷,或無(wú)油的加壓氣瓶。不要試圖擦拭鏡頭紙過(guò)濾器,以避免劃傷或擦傷,軟干擾涂層的表面。

 


尼康SMZ1500如用立體顯微鏡,廣泛的標本,可以在熒光照射下成像。物鏡的放大倍率為0.5倍至15倍的1.6倍的變焦跨度,在顯微鏡能夠540X,考慮到的一個(gè)經(jīng)典的化合物顯微鏡體視顯微鏡觀(guān)察范圍內,共提供4倍的倍率廣度。這種廣泛的緯度使顯微鏡的放大倍率形象都大活標本和熒光標記的薄切片在顯微鏡玻片上安裝微小的細節上。熒光觀(guān)察的高倍率范圍內的一個(gè)例子示出在圖4中的三重標記的小鼠腎組織的粗節。標記的Alexa Fluor 488WGA,用DAPIAlexa Fluor 568(得自Molecular Probes公司的Alexa Fluor探針和試樣)試樣,并使用三個(gè)過(guò)濾器的組合列于表1藍綠色熒光蛋白/ DAPI,成像賦予GFP的帶通濾波器,和TRITC DsRed。此圖片清楚地說(shuō)明了高倍率能力原本準備復合顯微鏡觀(guān)察標本的熒光體視顯微鏡。


stereo fluorescence figure4


其他體視顯微鏡制造商提供替代照明策略,激發(fā)和觀(guān)察。最流行的配置,如圖5所示,熒光激發(fā),不利用顯微鏡的成像光學(xué)系統包括一個(gè)外部通路。照明從電弧燈箱的第一通過(guò)激發(fā)濾光片,然后通過(guò)管定位在主顯微鏡主體的后部。管的下部配備的透鏡系統,引導到樣品上的激發(fā)光波長(cháng)。此配置可確保光線(xiàn)被直接引導到標本在所有倍率變焦位置,提供所有倍率同樣強烈的熒光照明均勻暗背景。

 

從被捕獲的標記的試樣中熒光發(fā)射通過(guò)的共同的主要物鏡(圖5),并通過(guò)變焦頻道和屏障過(guò)濾器定位在顯微鏡頭成一組。從那里時(shí),光被引導到目鏡直接觀(guān)察或成數字成像或顯微攝影攝像管。此配置中的主要好處是缺乏的二色性反射鏡的一個(gè)要求,和獨立于預先配置的過(guò)濾器的組合塊,這使得研究者有所更自由地進(jìn)行過(guò)濾器的選擇。但是,配置也可能導致錯誤,缺乏經(jīng)驗的運營(yíng)商試圖觀(guān)察標本不正確的過(guò)濾器組合。


stereo fluorescence figure5


強烈的紫外線(xiàn)輻射所產(chǎn)生的汞弧燈作為光源,在熒光顯微鏡利用觀(guān)察者的眼睛的視網(wǎng)膜,可以造成損壞。為了避免這種情況,許多顯微鏡制造商包括保護裝置在顯微鏡體,可過(guò)濾紫外線(xiàn)光洗澡標本在顯微鏡舞臺上。其他的安全預防措施,包括紫外線(xiàn)阻隔過(guò)濾器觀(guān)察路徑和雜散光保護周?chē)臒粝?。此外,假人過(guò)濾運營(yíng)商往往是空置過(guò)濾器的位置插入熒光干擾過(guò)濾器滑塊和旋轉框架設計。

 

熒光體視顯微鏡通常配備停止定位介于汞燈箱和阻擋有害紫外線(xiàn)輻射的垂直照明從燈標本時(shí)不被觀(guān)察或成像光。此停止應始終被插入光路時(shí),不進(jìn)行觀(guān)測。


反射,或熱點(diǎn)可以發(fā)生在使用復消色差物鏡更高的放大倍率(1.6倍至2.0倍)的標本,在熒光立體顯微鏡觀(guān)察時(shí)的視場(chǎng)的下部。此神器通常是唯一可見(jiàn)的變焦比率較低時(shí),往往消失的變焦倍數增加。在大多數情況下,反射問(wèn)題不發(fā)生較低倍物鏡(0.5X1.0X),無(wú)論光學(xué)校正因子,通常缺席下校正(消色差透鏡和計劃消色差透鏡)的高倍率物鏡。

 

存在范圍廣泛的應用程序熒光調查,利用體視顯微鏡,列于表2。受益于這種觀(guān)察模式標本的數量是相當大的,涵蓋廣泛的學(xué)科,包括那些從生物領(lǐng)域到工業(yè)制造商不等。



熒光立體顯微鏡的應用


領(lǐng)域


應用


生物學(xué)


基因表達,細胞分選,解剖,發(fā)育過(guò)程,眼睛和肌肉調查


植物學(xué)


植物細胞,組織自體熒光,土壤樣品和寄生蟲(chóng)


藥理


毛細管流量,藥物,ELI觀(guān)察


水文學(xué)


水質(zhì),細胞結構,濾膜分析


農學(xué)


種子觀(guān)察,基因的表達,并Transgenetics


電子


錫膏,環(huán)氧樹(shù)脂分析,監控涂料,聚合物鑄件集成電路


半導體


抵制污染,雜質(zhì)顆粒,過(guò)程錯誤


聚合物


外來(lái)顆粒,空洞,珠分析,非聚合區


金工


裂縫和表面缺陷,污染,焊接控制,斷裂分析


物料


裂紋,焊接,粘接碳,骨折,取向研究


造紙


光纖涂料和夾雜物


取證


紡織纖維,體液,指紋,銀行票據,偽造


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熒光觀(guān)察在立體顯微鏡提供的獨特的屬性的三維觀(guān)察時(shí)相比,提出的一個(gè)古典化合物顯微鏡的視圖。此外,更大的工作距離和景深立體技術(shù)所提供的啟用更寬的全景視圖字段和更強烈的熒光。這些功能是巨大的利益,調查人員正試圖處理大量的生物標本和材料的技術(shù)人員正在開(kāi)展準備工作,如嵌入,電子檢查,或切割。作為更清楚地定義的過(guò)濾器組合成為可用于專(zhuān)門(mén)的應用程序,利用熒光立體顯微鏡繼續攀升。




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