徠卡顯微鏡 - 熒光壽命成像之FLIM-FRET應用淺析

2020-09-04 09:57:49 admin
奧林巴斯顯微鏡

FRET 技術(shù)(Fluorescence Resonance Energy Transfer)能夠在突破傳統光學(xué)分辨率極限的條件下研究蛋白互作、構象變化(<10 nm),或者通過(guò)構建 FRET 探針監測分子變化,因而在諸多研究領(lǐng)域得到了“科研大拿”們的青睞。然而,傳統的基于熒光強度的 FRET 技術(shù)(如 FRET-AB、FRET-SE 等)容易受到熒光蛋白濃度、激光強度、熒光漂白等眾多因素的影響,從而直接導致了實(shí)驗結果的不準確性和難重復性,著(zhù)實(shí)讓人頭疼!


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△ 圖1. 常用 FRET 染料對 Alexa488-Cy3 的 Jablonski 圖表



FLIM 顯微成像技術(shù)

FLIM-FRET 的優(yōu)勢

FLIM(Fluorescence Life-time Imaging Microscopy) 是一項基于熒光壽命(電子駐留在激發(fā)態(tài)的時(shí)間統計值)的顯微成像技術(shù)。與熒光光譜一樣,熒光壽命也是熒光物質(zhì)的一種內在特有性質(zhì),不受熒光物質(zhì)濃度、激發(fā)光強度等因素的影響。基于熒光壽命測量的 FRET 技術(shù)—— FLIM-FRET,具有 FLIM 和 FRET 兩者的優(yōu)勢,即能在不受熒光強度影響因素影響的條件下,在納米分辨率水平對蛋白互作進(jìn)行研究,或者通過(guò) FRET 探針研究分子環(huán)境變化,更重要的是其測量數據準確性高、易重復,接下來(lái)我們來(lái)看兩個(gè)例子。


案例解析


案例一

離子溶度監測

今年發(fā)表在 Nature Immunology 上的文章 “An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development” 研究了 ZIP7 蛋白在 B 細胞中的重要作用。


作者通過(guò)對免疫缺陷病人進(jìn)行基因篩查,發(fā)現了 ZIP7 蛋白的缺失,利用 CRISPR-CAS9 技術(shù)構建了該基因缺失的小鼠模型,并利用該模型證明了 ZIP7 缺失會(huì )導致 B 細胞發(fā)育受阻。ZIP7 介導 Zn2+ 由內質(zhì)網(wǎng)流入細胞質(zhì),為了證明 ZIP7 缺失的細胞中 Zn2+ 濃度受到了影響,作者通過(guò) FRET 探針 eCALWY-4、eCALWY-6 進(jìn)行了研究,然而傳統的FRET技術(shù)會(huì )受到探針濃度的影響從而導致結果不準確,因此作者利用了 FLIM-FRET 技術(shù),證明 ZIP7 突變體細胞質(zhì)中 Zn2+ 濃度明顯下降,后續的實(shí)驗進(jìn)一步證明了 ZIP7 調控的 Zn2+ 水平對 B 細胞發(fā)育的重要性。

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△ 圖2. 利用 FLIM-FRET 技術(shù)檢測細胞質(zhì)和內質(zhì)網(wǎng)中 Zn2+ 濃度。P198A Hom,ZIP7 突變體;eCALWY-4、eCALWY-6 ,Zn2+  FRET reporters ; ER,內質(zhì)網(wǎng)



案例二

活體功能成像

FRET 探針不僅可用在細胞水平,in vivo 個(gè)體水平也同樣適用。


“Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data” 一文利用 Rac1 FRET 探針對小鼠小腸、胰腺等組織中的 Rac1 活性進(jìn)行了監測。然而,傳統的 FLIM 技術(shù)成像速度非常慢,在活體應用時(shí),由于時(shí)間分辨率不夠會(huì )導致數據的假象。該文通過(guò)算法將這種成像速度不夠導致的假象進(jìn)行了*大程度的消除,從而在一定程度上促進(jìn)了 FLIM 在活體水平的應用,該文章發(fā)表在2018年 eLife 雜志上。

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△ 圖3. 左,Rac1 FRET 探針檢測小腸隱窩處 Rac1 活性模式圖;右,運動(dòng)補償運算前后 FLIM 數據對比



SP8 FALCON *快速熒光壽命成像

解決 FLIM 成像速度*大瓶頸

當然, FLIM 應用并不僅限于 FLIM-FRET,通過(guò) FLIM 還可以對樣本所處的微環(huán)境進(jìn)行檢測、對樣品組份進(jìn)行分離等等。在傳統的熒光強度和熒光光譜兩個(gè)維度的基礎上,又增加了熒光壽命這一新的成像維度,大大拓展了該系統的應用范圍。


然而,正如 Sean C Warren eLife 文章所說(shuō),FLIM 成像速度慢是限制其應用的*大瓶頸。


Leica*新 SP8 FALCON *快速熒光壽命成像解決方案,使 FLIM 成像速度提升了近10倍(較經(jīng)典 TCSPC 方法),近共聚焦的成像的速度幾乎能滿(mǎn)足所有動(dòng)態(tài)過(guò)程的速度要求,可輕松實(shí)現 XYZTλ 多方式快速熒光壽命成像。

△ 視頻1. 對 Alexa Fluor 555 溶液中的熒光小球(品紅色)進(jìn)行快速熒光壽命成像。

使用FLIM比熒光強度(左)更有利分離目標。單幀大?。?12 x 64 像素。比例尺:10 微米


同時(shí),該系統基于 Leica SP8 共聚焦成像平臺,可與白激光 STED 3X 納米顯微鏡、DIVE 多光子系統等相結合,形成基于一個(gè)平臺的 STED-FLIM、DIVE-FLIM 多模態(tài)成像。


參考文獻:

1. Consuelo Anzilotti et.al., Nature Immunology, 2019 Vol 20 350-361, An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development.

2. Sean C Warren et.al., eLife, 2018 7:e35800, Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data. 

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